REPLI-g單細(xì)胞試劑盒

從單個(gè)細(xì)胞或有限的樣品材料中進(jìn)行高度均勻的全基因組擴(kuò)增（WGA）

• 單細(xì)胞材料的WGA具有完整的基因組覆蓋范圍
• 由于MDA技術(shù)，基因組基因座的無(wú)偏擴(kuò)增
• 經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可與包括NGS在內(nèi)的新技術(shù)配合使用
• 一致的產(chǎn)量高達(dá)40 µg（平均產(chǎn)物長(zhǎng)度> 10 kb）
• 用于癌癥研究，干細(xì)胞研究或宏基因組學(xué)的新型工具

使用創(chuàng)新儀器（例如下一代測(cè)序（NGS）平臺(tái)）進(jìn)行生物樣品的DNA序列分析和基因分型通常受限于少量樣品。REPLI-g單細(xì)胞試劑盒專門設(shè)計(jì)用于從單細(xì)胞（1至<1000個(gè)細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞）或純化的基因組DNA中均勻擴(kuò)增基因組DNA，并具有完整的基因組覆蓋范圍。其他協(xié)議也可用于新鮮或干燥血液或新鮮或冷凍組織。的緩沖液和試劑經(jīng)過(guò)*的受控去污程序，以避免擴(kuò)增污染性DNA，從而確保每次都獲得高度可靠的結(jié)果。創(chuàng)新的多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)可實(shí)現(xiàn)具有可忽略的序列偏倚且無(wú)基因組缺失的基因組準(zhǔn)確擴(kuò)增。

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒適用于分子生物學(xué)應(yīng)用。本產(chǎn)品不用于診斷，預(yù)防或治療疾病。

產(chǎn)品詳情

性能

完整的基因組覆蓋范圍，非常適合NGS和其他下游應(yīng)用

使用REPLI-g單細(xì)胞試劑盒擴(kuò)增的DNA的平均產(chǎn)物長(zhǎng)度> 10 kb，并具有大的基因組覆蓋范圍。它已通過(guò)眾多下游分析進(jìn)行了測(cè)試，并非常適用于這些分析，包括下一代測(cè)序（NGS），陣列比較基因組雜交（aCGH）和基于實(shí)時(shí)PCR的應(yīng)用（請(qǐng)參見(jiàn)表2）。由于不需要單獨(dú)的基于PCR的擴(kuò)增步驟，因此與基于PCR的方法相比，REPLI-g全基因組擴(kuò)增和文庫(kù)制備所需的動(dòng)手時(shí)間更少，讀取長(zhǎng)度更長(zhǎng)（請(qǐng)參見(jiàn)“使用與基于PCR的方法相比，REPLI-g擴(kuò)增的DNA需要更少的動(dòng)手時(shí)間并產(chǎn)生更多的序列信息“）。高質(zhì)量的，可比的NGS結(jié)果表明，純化的基因組DNA或REPLI-g單細(xì)胞擴(kuò)增的DNA均可實(shí)現(xiàn)高百分比的序列覆蓋率和非常低的錯(cuò)誤率，包括僅從單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞開(kāi)始的情況（見(jiàn)圖） “可比NGS結(jié)果”）。這些發(fā)現(xiàn)是通過(guò)寬范圍的標(biāo)記覆蓋所有人類常染色體和X染色體的全面分析強(qiáng)調(diào)，具有3個(gè)不同的獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)表明DNA被成功地從基因組的所有區(qū)域擴(kuò)增無(wú)單次輟學(xué)（見(jiàn)圖“完整的基因組覆蓋范圍”）。

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒優(yōu)于其他供應(yīng)商的試劑盒

其他供應(yīng)商通常使用的基于PCR的WGA方法導(dǎo)致短片段被PCR引物序列終止，這可能會(huì)影響下游過(guò)程（例如，下一代測(cè)序；請(qǐng)參見(jiàn)圖“使用REPLI-g擴(kuò)增的DNA進(jìn)行的下一代測(cè)序需要更少的動(dòng)手時(shí)間，比基于PCR的方法產(chǎn)生更多的序列信息”）。基于PCR的WGA可能導(dǎo)致容易出錯(cuò)的擴(kuò)增，例如，導(dǎo)致單個(gè)堿基對(duì)突變，STR收縮和擴(kuò)增，并且由于使用低保真酶Taq而導(dǎo)致基因座的偏倚和代表性不足DNA聚合酶。相比之下，REPLI-g單細(xì)胞試劑盒可在整個(gè)基因組中提供高度均勻的擴(kuò)增，且擴(kuò)增過(guò)程中基因座偏向小。使用每種試劑盒*的單細(xì)胞擴(kuò)增方案，測(cè)試了四種WGA試劑盒（包括REPLI-g單細(xì)胞試劑盒）和2種利用MDA技術(shù)的2種基于PCR的方法的序列表示和基因座缺失。與REPLI-g單細(xì)胞試劑盒不同，使用其他供應(yīng)商的試劑盒分析的單細(xì)胞通常無(wú)法完整無(wú)偏地顯示序列（請(qǐng)參見(jiàn)“從單細(xì)胞無(wú)偏DNA擴(kuò)增”圖）。

原理

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒包括REPLI-g sc聚合酶，這是創(chuàng)新的高保真酶Phi 29聚合酶的優(yōu)化配方，可使用多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)擴(kuò)增復(fù)雜的基因組DNA，并進(jìn)行溫和的堿性孵育以確保非常低的DNA/片段化或無(wú)堿基位點(diǎn)的產(chǎn)生。它經(jīng)過(guò)專門設(shè)計(jì)，可從單個(gè)細(xì)胞（例如分離的腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌）提供高產(chǎn)量的擴(kuò)增DNA（請(qǐng)參見(jiàn)表1）。此外，它還可以用于各種臨床和非臨床研究樣品以及純化的基因組DNA，同時(shí)還可以使用其他方案來(lái)處理新鮮或干燥的血液以及新鮮或冷凍的組織。無(wú)論模板的起始量如何，典型的DNA產(chǎn)量始終可達(dá)到40 µg，這意味著隨后的遺傳分析無(wú)需進(jìn)一步測(cè)量DNA濃度即可進(jìn)行。平均產(chǎn)物長(zhǎng)度超過(guò)10 kb，并且具有完整的基因組覆蓋范圍，確保使用REPLI-g單細(xì)胞試劑盒擴(kuò)增的DNA非常適合眾多下游應(yīng)用，包括下一代測(cè)序（NGS），基于陣列的比較基因組雜交（陣列CGH） ），焦磷酸測(cè)序和實(shí)時(shí)PCR分析（表2）。

放大原理

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒使用等溫基因組擴(kuò)增，稱為多重置換擴(kuò)增（MDA），涉及隨機(jī)六聚體與變性DNA的結(jié)合，然后在恒定溫度下用優(yōu)化形式的Phi 29聚合酶進(jìn)行鏈置換合成，它具有異常強(qiáng)的股線位移特性。在每條置換的鏈上都可充當(dāng)模板，從而引發(fā)額外的引發(fā)事件，從而可產(chǎn)生高產(chǎn)量的擴(kuò)增DNA（見(jiàn)圖“多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)”）。Phi 29聚合酶是一種噬菌體衍生的酶，是一種具有3'→5'主要核酸外切酶活性（校對(duì)活性）的DNA聚合酶，其保真度比Taq高1000倍DNA聚合酶。在*，優(yōu)化的REPLI-g單細(xì)胞緩沖液系統(tǒng)的支持下，Phi 29聚合酶可以輕松解決二級(jí)結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾環(huán)），從而防止擴(kuò)增過(guò)程中聚合酶的滑動(dòng)，終止和解離。這樣就可以產(chǎn)生高達(dá)100 kb的DNA/片段，而不會(huì)產(chǎn)生序列偏倚（請(qǐng)參見(jiàn)“用Phi 29聚合酶進(jìn)行無(wú)偏擴(kuò)增”）。

DNA的細(xì)胞裂解和堿變性

在用于酶促擴(kuò)增程序之前，必須先對(duì)基因組DNA進(jìn)行變性，這通常使用苛刻的方法完成，例如在高溫下孵育（熱孵育）或在pH值升高（化學(xué)堿性孵育）的情況下。REPLI-g單細(xì)胞試劑盒使用溫和的堿性孵育，可實(shí)現(xiàn)gDNA的細(xì)胞裂解和均勻的DNA變性，而DNA/片段化程度極低或無(wú)堿基位點(diǎn)的產(chǎn)生。這導(dǎo)致擴(kuò)增的DNA具有非常高的完整性，并大化了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，因此基因組位點(diǎn)和序列被均勻地表示（參見(jiàn)“熱和堿變性對(duì)位點(diǎn)表示的影響”圖）。

有效消除可檢測(cè)的DNA污染

所有REPLI-g單細(xì)胞試劑盒組件均經(jīng)過(guò)*的受控去污程序，以確保消除所有REPLI-g可擴(kuò)增的污染DNA。通過(guò)創(chuàng)新和標(biāo)準(zhǔn)化的程序?qū)⒕彌_液和試劑暴露在紫外線輻射下，以確保不存在任何可檢測(cè)到的殘留污染性DNA（請(qǐng)參見(jiàn)“創(chuàng)新性去污程序”圖）。經(jīng)過(guò)紫外線處理后，套件會(huì)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，以確保完整的功能。

程序

簡(jiǎn)單的一管程序

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒使用簡(jiǎn)單可靠的方法從單細(xì)胞或有限樣品中獲得準(zhǔn)確的基因組擴(kuò)增。簡(jiǎn)單的反應(yīng)設(shè)置和非常短的處理時(shí)間（約15分鐘）使這成為一種簡(jiǎn)單而可靠的方法（請(qǐng)參見(jiàn)“ REPLI-g單細(xì)胞試劑盒程序”圖）。已開(kāi)發(fā)出的緩沖液和試劑，可從單個(gè)細(xì)胞，有限的組織材料和純化的DNA中獲得高產(chǎn)量的DNA，并具有完整的序列表示和無(wú)偏擴(kuò)增（表3）。REPLI-g擴(kuò)增的DNA可以在–20°C下長(zhǎng)期保存，不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響（請(qǐng)參見(jiàn)“一致的長(zhǎng)期穩(wěn)定性”圖）。